在出生后关键期内，通过眼睑闭合对幼猫进行单眼剥夺（MD），会减少背外侧膝状体（dLGN）中与剥夺眼相连层面的神经元体积，并使皮层眼优势向非剥夺眼转移，模拟了人类的剥夺性弱视。在长期MD之后，通过微注射河豚毒素暂时性失活非剥夺眼的视网膜，可以促进MD的更好恢复，且在较大年龄时相比传统遮盖疗法效果更佳。这表明单眼失活（MI）是比遮盖更能有效诱导神经可塑性的方法。在本研究中，我们通过评估dLGN中神经元体积的改变，来衡量在出生后发育不同阶段施加短暂MI的影响。当MI发生在眼优势可塑性关键期峰值时，观察到最大的影响。MI的效应在dLGN的双目和单目区段均可见，这与仅在双目区段产生变化的MD不同。随着年龄增长，失活改变突触后细胞体积的能力减弱，但在经典关键期之后仍具有显著效应。与MD相比，失活产生的效果始终约为两倍大，且失活能在比MD更大的年龄时有效诱导神经改变。尽管失活引发了显著的神经改变，其解剖学效应可通过短暂的双眼视觉体验得到修复，且TTX洗脱后，之前失活眼的视力完全恢复。我们的结果表明，MI是修饰视觉通路的强有力手段，且能在遮盖有效的年龄之后继续发挥作用。失活诱导神经改变的幅度和持久性突显了其在改善弱视等视觉系统疾病方面的潜力。
一、引言
视觉神经回路早期产后发育的一个重要因素是正常双眼视觉的提供。在发育的关键期——一个形成性和高度可塑性的阶段，清晰和平衡视觉的受阻可以产生神经连接的重新排列，之后视觉系统表现出对视觉刺激的异常反应。即使经过短暂的眼睑闭合单眼剥夺（MD），视觉皮层的生理反应也会偏向非剥夺眼，使剥夺眼只能控制少数皮层神经元的活动。在猫和猴子中，MD诱发的皮层眼优势生理转变伴随着双眼视觉皮层内的解剖学改变，包括剥夺膝状体纹状轴突末梢的退缩。视觉皮层中轴突的这种简化与其背外侧膝状体（dLGN）中亲代胞体体积的减少相关。由于细胞体收缩仅在服务于双眼视野的dLGN区域（核的"双眼段"）观察到，因此不被认为是改变的视网膜（顺向）活动本身的后果。相反，MD后的胞体缩小被认为是双眼视觉皮层中来自两只眼睛的会聚输入之间相互作用的逆行反应。这一解释得到以下发现的支持：dLGN细胞大小的双眼竞争控制依赖于视觉皮层内的突触可塑性。
MD产生的神经畸变被认为代表伴随视觉障碍的核心病理——剥夺性弱视，其特征是空间敏锐度的显著降低以及双眼性和立体感的丧失。如果在高度可塑性的关键期内打开剥夺眼并闭合原本非剥夺眼，MD效应的逆转是可能的，这一程序称为反向遮盖，类似于人类全时遮盖治疗弱视。与遮盖一样，在关键期之后可塑性能力较低的年龄应用反向遮盖，对引发先前MD期结构和功能后果的恢复潜力有限。这种与年龄相关的恢复顽固性在人类中也有观察到，对于由剥夺产生的弱视尤其令人担忧，因为与其他形式的疾病相比，其恢复窗口更受限。
最近的小鼠和猫研究表明，如果优势眼的视网膜通过玻璃体内微量注射河豚毒素（TTX）暂时失活，关键期后的MD恢复可以发生，TTX是一种电压门控钠通道阻断剂，可逆地消除视网膜神经节细胞活动。在MD期之后，优势眼（同伴眼）的失活恢复了对较弱眼的神经反应，并促进了MD诱导的dLGN神经元胞体大小萎缩的恢复。重要的是，这种从MD效应中的恢复发生在反向遮盖无法促进从原始剥夺事件显著恢复的年龄。虽然引发失活后恢复的机制仍未知，目前正在探索，但失活作为恢复策略的卓越疗效相对于遮盖疗法表明，这两种程序对视觉系统的影响不相等。
当前研究的目标是调查这两种治疗方法（暂时形式剥夺与失活）之间的潜在差异。我们选择测量视觉剥夺的解剖学标志，作为探测两种程序影响和评估单眼眼睑闭合与单眼视网膜失活之间潜在差异的手段，最终目标是为失活促进神经恢复的卓越疗效提供见解。一种可能性是MI在视觉系统中产生的效果反映了MD的效果，但幅度更大。另一种可能性是两种形式视觉剥夺引发的神经修改表现出相似性，但总体上根本不同。后一种可能性与早期研究一致，该研究表明两种条件对视觉皮层可塑性的影响不同。
50多年来，猫dLGN内神经元胞体大小的测量为评估MD对初级视觉通路神经元结构和功能的影响提供了一种可靠、稳健和敏感的手段。在本研究中，我们通过测量发育不同年龄dLGN内修改的幅度和视网膜拓扑位置，比较了MD与视网膜失活的效果。猫dLGN的眼特异性层状和视网膜拓扑组织使其成为选择性量化两种单眼操作引发的神经变化幅度和地形的理想选择。重要的是，这种实验设计实现了动物内部受影响眼层和正常眼层之间的比较，可以避免动物间高变异性等问题引起的并发症，这在研究中使用高等哺乳动物时特别有用，因为受试者数量通常较低。
二、方法
2.1 动物
解剖学研究在15只猫上进行，这些猫都在达尔豪斯大学的封闭繁殖群中出生和饲养。饲养和实验程序按照达尔豪斯大学动物实验委员会批准的方案进行，并符合加拿大动物护理委员会的指导方针。本研究中一些动物的组织是为先前研究收集的，这些动物的样本来自我们的猫脑组织库。我们检查了来自三组动物的dLGN切片，其饲养历史详见表1。动物通过眼睑闭合进行MD饲养（n=5；3只雄性，2只雌性），或通过MI饲养（n=8；4只雄性，4只雌性），或在双眼视觉期前接受MI（n=2；1只雄性，1只雌性）。我们MD组动物的组织来自我们的脑库，一只眼睛的眼睑闭合14天，从出生后第30天（P30，眼优势可塑性的峰值）或更晚的年龄（P42和P70）开始，此时MD转变眼优势的效力已减弱。选择这14天的MD持续时间是因为相对于我们的视网膜失活组，它代表了最接近的可用剥夺持续时间。对照组动物的一只眼睛失活10天，从P30、P42、P70或22周龄开始。
2.2 单眼剥夺
动物在全身气体麻醉（氧气中3-4%异氟烷）下进行单眼剥夺，程序涉及用无菌5-0薇乔线闭合左眼上下睑结膜，然后用5-0丝线缝合眼睑。程序完成后，动物给予美达康（0.05 mg/kg）进行术后镇痛，局部麻醉通过应用Alcaine无菌眼科溶液（1%丙美卡因盐酸盐）产生，并施用广谱局部抗生素（1%氯霉素）以减轻术后感染。每天监测眼睑闭合质量，确保眼睑健康且完全闭合。
2.3 视网膜失活
视网膜失活在全身麻醉下进行，使用氧气中3-4%异氟烷。与我们先前的研究一致，动物用玻璃体内微量注射TTX（ab120055；abcam，USA）使右眼失活，TTX溶解在柠檬酸盐缓冲液中，浓度为2mM。对于每只动物，剂量根据眼睛大小调整。我们每毫米玻璃体腔长度给予0.5 μl TTX。该近似剂量阻断受影响细胞的动作电位，而不阻碍关键细胞功能，如快速轴浆运输。玻璃体内注射通过用30号一次性无菌针头穿刺进行，该针头在平坦部位置的巩膜上产生一个小孔。用带有固定30号针头（针尖样式4）的消毒Hamilton注射器（Hamilton Company，USA）将测量的TTX溶液体积缓慢注入玻璃体腔。针头通过原始穿刺定位，并以远离晶状体的角度放置5-10 mm进入腔室。缓慢注入TTX总体积，然后针头保持原位约一分钟后再 retracted。眼内注射后，局部抗生素（T-1%；Aventix，Canada）和麻醉剂（Alcaine；Alcon，Canada）应用于眼睛以防止注射后并发症。给予美达康（0.05 mg/kg）进行术后镇痛。为了实现10天的视网膜失活，动物接受5次注射，每48小时一次，每次注射使用原始穿刺部位以避免需要制作另一个孔。在失活期间，我们通过注意到失活眼由于瞳孔扩张导致的瞳孔不等大、瞳孔光反射缺失以及缺乏视觉运动行为（如视觉放置、视觉惊吓和使用失活眼追踪移动激光点的能力）来确认失活。这些评估在非注射眼用不透明接触镜短暂遮盖时进行。
2.4 组织学样本制备
为准备组织学，动物用致死剂量的戊巴比妥钠（Pentobarbital Sodium；150 mg/kg）安乐死，随后通过心脏灌注约150 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后灌注等量含4%溶解多聚甲醛的PBS。立即提取脑组织，并从脑的其余部分解剖丘脑以准备dLGN进行切片和组织学处理。包含dLGN的组织进行冷冻保护，然后使用滑动切片机冠状切成25μm厚的切片。我们脑库中的一些切片以50μm切割。组织切片储存在-20°C的抗原保存溶液中，直至用于研究。本研究中检查的所有组织都经过相同的提取和制备程序，相同的储存设置，所有动物的切片都按照相同的方案染色。
2.5 尼氏染色
对于每只动物，将包含左右LGN的6个切片安装在载玻片上，并用1%尼氏溶液（ab246817；Abcam，USA）染色。染色切片在70%乙醇中分化，然后在分级乙醇系列中脱水，然后用Histo-Clear透明。切片然后用封片剂（Permount；Fisher Scientific，Canada）盖片，干燥后进行显微镜评估。
2.6 解剖学定量
本研究中的测量对每只动物的饲养条件不知情。使用计算机化体视学系统（newCAST；VisioPharm，Denmark）上可用的核探针，从尼氏染色切片测量左右dLGN的A和A1层中神经元胞体的横截面积。所有面积测量使用配备60X油浸物镜（Olympus；Canada）的BX-51复合显微镜进行。使用既定选择标准将神经元与胶质细胞区分，包括测量具有深色细胞质和核仁染色以及浅色核染色的细胞。遵守这些标准可以避免细胞帽，并确保测量取自近似胞体中线的神经元。每只动物测量约500-1000个神经元。
MD和MI的影响使用我们先前使用的眼优势指数（ODI）计算，该指数揭示了眼特异性dLGN层之间的百分比差异：
ODI = (((非剥夺A1 + 非剥夺右侧A) - (剥夺左侧A + 剥夺右侧A1)) / (非剥夺左侧A1 + 非剥夺右侧A)) × 100
通过将每层平均胞体大小视为单个观察值，然后采用非配对（单尾）t检验来确定受影响神经元是否比服务于正常眼的神经元更小，从而进行每种条件下眼特异性层之间的统计比较。使用指数增长曲线表征MI跨年龄的影响，并使用Pearson积矩相关系数计算拟合优度。
2.7 生理学：视觉诱发电位
所有猫记录都在麻醉动物中进行，全视野视觉刺激呈现在LCD监视器上，位于双眼视野，观看距离为70 cm。在每次记录会话准备中，动物用1-1.5%异氟烷麻醉，并肌肉注射乙酰丙嗪（0.06-0.1mg/kg）提供补充镇静。头部毛发修剪，用一次性剃刀剃除记录部位所在的头皮部分，两个位置大约位于耳间零点后2-8 mm和外侧1-4 mm，位于左右初级视觉皮层的推定位置，另一个位置位于额叶中线，作为参考。电极部位用Nuprep EEG皮肤准备凝胶研磨，然后用酒精垫清洁。可重复使用的10 mm金杯Grass电极（FS-E5GH-48）用Ten20 EEG导电膏固定在头皮上。测量记录电极相对于参考电极的阻抗，确保每个值低于5 kΩ。电生理信号使用Intan头级（RHD2132；20kHz采样频率）放大和数字化，然后使用Open Ephys采集板和GUI软件记录。刺激使用Matlab中开发的定制软件生成，使用Psychophysics Toolbox扩展，由全对比度方波光栅组成，对比度反转频率为2 Hz。不同空间频率（0.05、0.1、0.5、1和2周/度（cpd））的光栅刺激块或亮度匹配的灰屏以伪随机顺序呈现20秒，灰屏在2秒刺激间隔期间也显示。每个块至少重复6次。通过在对侧眼前放置黑色遮挡器，每只眼睛单独测试。眼睛用小开睑器保持睁开，并经常用保湿滴眼液润滑。记录会话持续约1小时，记录后至少观察动物行为1小时以确保完全恢复。
2.8 生理学定量
原始脑电图导入MATLAB，在其中进行1 Hz以上高通滤波，然后进行傅里叶分析。VEP的幅度计算为刺激基频加上6个额外谐波（2-14 Hz）的功率总和。基线非视觉活动计算为从视觉响应偏移0.2 Hz频率（2.2-14.2 Hz）的功率总和。为了评估跨实验条件每只眼睛VEP功率的可能差异，采用重复测量方差分析，使用Holm-Sidak多重比较检验，将左右V1在0.05 cpd和0.1 cpd刺激的测量视为单个观察值。
三、结果
3.1 单眼剥夺
我们通过测量dLGN内14天MD的效果开始研究。选择这种MD持续时间作为10天MI效果的比较，因为在我们的脑库样本中，这段MD期虽然略长，但最接近匹配。
在关键期峰值（P30）开始施加14天MD，导致剥夺dLGN层内神经元大小的显著降低，这在显微镜检查中很容易观察到（图1A）。与研究人员（1970）的发现一致，剥夺神经元仅在dLGN层的双眼段中明显小于非剥夺对应神经元（图1B），在那里服务于左右眼的神经元轴突在V1水平受到竞争。在位于A层外侧的单眼段中，神经元投射到V1的单眼新月形表征，非剥夺和剥夺胞体大小之间没有明显差异（图1C）。从双眼段测量的神经元横截面积立体学定量显示，剥夺神经元（平均值=190μm²；SD=9μm²）比非剥夺神经元（平均值=253μm²；SD=14μm²；图1D）小25%，这种差异显著（t=7.498，d.f.=6，p<0.001）。然而，在单眼段内，剥夺（平均值=195μm²；SD=13μm²）和非剥夺（平均值=185μm²；SD=12μm²）神经元仅相差5%（图1E），这不是统计学显著差异（t=0.847，d.f.=2，p>0.05）。
当相同的14天MD在发育后期，10周龄时施加，我们在dLGN中观察到较小的效果（图1F）。在这个较老的年龄，双眼段内的剥夺神经元仅略小于非剥夺神经元（图1G），且位于单眼段内的神经元大小没有注意到差异（图1H）。神经元胞体大小的量化反映了我们观察到的，在10周龄时，14天MD在双眼段内的效果降低（剥夺：平均值=213μm²，SD=23μm²；非剥夺：平均值=228μm²；SD=20μm²；图1I），在单眼段内几乎没有效果（剥夺：平均值=184μm²，SD=13μm²；非剥夺：平均值=183μm²；SD=12μm²；图1J）。双眼段内剥夺和非剥夺神经元大小之间的差异为7%，但不显著不同（t=1.236，d.f.=10，p>0.05），单眼段内剥夺和非剥夺神经元仅相差1%，也不显著不同（t=0.096，d.f.=4，p>0.05）。这些结果表明，在这个较老的年龄，MD对dLGN神经元大小的影响减弱且不显著。
图1. 单眼剥夺对dLGN神经元胞体大小的影响。A 在关键期峰值（P30）开始14天MD后dLGN的代表性低倍图像。B 双眼段内剥夺和非剥夺层的高倍图像。C 单眼段内剥夺和非剥夺层的高倍图像。D 双眼段内剥夺和非剥夺神经元的平均横截面积。E 单眼段内剥夺和非剥夺神经元的平均横截面积。F 在10周龄开始14天MD后dLGN的代表性低倍图像。G 双眼段内剥夺和非剥夺层的高倍图像。H 单眼段内剥夺和非剥夺层的高倍图像。I 双眼段内剥夺和非剥夺神经元的平均横截面积。J 单眼段内剥夺和非剥夺神经元的平均横截面积。
3.2 视网膜失活
单眼视网膜失活的效果在定量和定性上与MD产生的效果不同。在关键期峰值开始的10天单眼视网膜失活，在连接到失活眼的dLGN层内产生了明显的改变，这在两只检查动物中的低倍镜下清晰可见（图2A和D）。在双眼段内，失活层包含的尼氏染色神经元比位于正常眼层内的神经元小44%（平均值=156μm²，SD=16μm²），且相对于正常眼层内的神经元（平均值=278μm²，SD=22μm²；图2B和C）呈现苍白外观。与MD后在单眼段观察到的相反，服务于失活眼的单眼段内的神经元明显更小（平均值=184μm²，SD=24μm²）且比正常眼层对应神经元更苍白（平均值=229μm²，SD=20μm²；图2E）。MD后单眼段内剥夺和非剥夺神经元之间没有胞体大小差异，而10天MI后我们观察到失活眼神经元明显小于正常眼神经元，量化为20%的差异（图2F）。失活后观察到的胞体大小减少在双眼（t=11，d.f.=10，p<0.001）和单眼（t=2.5，d.f.=4，p<0.05）段都统计学显著。
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图2. 视网膜失活对dLGN神经元胞体大小的影响。A 在关键期峰值（P30）开始10天MI后dLGN的代表性低倍图像。B 双眼段内失活和正常眼层的高倍图像。C 双眼段内失活和正常眼神经元的平均横截面积。D 单眼段内失活和正常眼层的高倍图像。E 单眼段内失活和正常眼层的高倍图像。F 单眼段内失活和正常眼神经元的平均横截面积。
随着我们开始视网膜失活的年龄增加，对dLGN内神经元大小的影响降低。虽然在10周龄开始的10天失活对胞体大小有明显影响（图3A和D），但与相同失活期在4周龄时观察到的相比减弱。在10周龄，连接到失活眼的双眼段内的神经元明显更小，但没有表现出在关键期峰值失活后观察到的明显染色苍白（图3B）。在单眼段内（图3E），失活眼层内的胞体大小减少同样明显；然而，效果幅度似乎不受年龄降低那么多。换句话说，与双眼段不同，单眼段内的失活眼神经元与关键期峰值失活后测量的相比，效果幅度仅略有降低。胞体面积量化支持这些观察，显示双眼段内失活眼神经元缩小23%（失活：平均值=207μm²，SD=3μm²；正常：平均值=272μm²；SD=18μm²；图3C），这与单眼段显示的胞体大小18%差异大致匹配（失活：平均值=202μm²，SD=5μm²；正常：平均值=249μm²；图3F）。测量的神经元胞体大小减少在双眼（t=7.242，d.f.=10，p<0.001）和单眼（t=6.453，d.f.=2，p<0.05）段都显著。这些结果表明，随着年龄增加，视网膜失活的效果幅度降低，但效果仍比相同时期MD在相同年龄施加时引发的效果大得多。失活对双眼和单眼段的影响相似，表明这个年龄的效果不是由服务于两只眼睛的膝状体皮层传入之间的竞争驱动的。
图3. 10周龄视网膜失活对dLGN神经元胞体大小的影响。A 在10周龄开始10天MI后dLGN的代表性低倍图像。B 双眼段内失活和正常眼层的高倍图像。C 双眼段内失活和正常眼神经元的平均横截面积。D 单眼段内失活和正常眼层的高倍图像。E 单眼段内失活和正常眼层的高倍图像。F 单眼段内失活和正常眼神经元的平均横截面积。
本研究中最老的动物在22周龄开始一只眼睛失活10天（图4）。在这个年龄10天MI对胞体大小的影响在低倍镜下不容易察觉（图4A和D）。即使在高倍镜下，失活的效果也不如我们检查的较年轻年龄时明显，这对双眼和单眼段都适用，没有显著差异（图4B和E）。胞体大小的立体学量化与我们的定性观察一致，显示双眼（图4C）和单眼（图4F）段内眼特异性神经元之间的小差异。双眼段失活眼层内的神经元（平均值=241μm²，SD=13μm²）比正常眼层内的神经元（平均值=269μm²，SD=17μm²）小10%，这是统计学显著差异（t=2.59，d.f.=6，p<0.05）。从单眼段获得类似结果，神经元相差8%（失活：平均值=229μm²，SD=10μm²；正常：平均值=250μm²，SD=9μm²；图4F）；然而，这不显著不同（t=2.237，d.f.=2，p>0.05）。
图4. 22周龄视网膜失活对dLGN神经元胞体大小的影响。A 在22周龄开始10天MI后dLGN的代表性低倍图像。B 双眼段内失活和正常眼层的高倍图像。C 双眼段内失活和正常眼神经元的平均横截面积。D 单眼段内失活和正常眼层的高倍图像。E 单眼段内失活和正常眼层的高倍图像。F 单眼段内失活和正常眼神经元的平均横截面积。
为了说明在不同产后年龄施加10天MI的影响，我们绘制了检查的各年龄双眼和单眼段失活和正常眼dLGN层之间胞体大小百分比差异（图5）。在双眼段内，视网膜失活的效果随年龄增加而逐渐下降（图5A）。从关键期峰值到22周龄，失活的效果降低了约75%，从平均效果大小44%下降到10%。值得注意的是，即使在我们检查的最老年龄22周龄，仍观察到失活的小残余效果。随年龄对失活敏感性下降被指数增长曲线很好地表征（R²=0.97）。MI的效果在双眼段内始终约为MD产生效果的两倍。单眼段内失活的效果也随年龄降低（图5B），数据也用指数增长曲线拟合（R²=0.72）。与双眼段相比，单眼段内失活效果随年龄增加而减弱较少，这是基于4周和10周龄时单眼段效果幅度相似的观察。总体而言，我们MI组的结果突出了与MD的明显差异，包括在较老年龄引发细胞大小变化的持久效力，以及在dLGN单眼段内产生改变的能力。
图5. 视网膜失活效果随年龄的下降。A 双眼段内失活和正常眼dLGN层之间胞体大小百分比差异随年龄的变化。B 单眼段内失活和正常眼dLGN层之间胞体大小百分比差异随年龄的变化。C 从双眼段差异中减去单眼段差异后的双眼竞争效应。
虽然在10周龄施加的MD仅产生dLGN的小变化，但在该年龄施加的视网膜失活显著降低了胞体大小，且幅度在双眼和单眼段相当。跨段的反应一致性提出了视网膜失活在这个年龄的效果由双眼竞争以外的东西驱动的可能性。事实上，当我们从双眼段差异（包括视觉皮层中双眼竞争的附加逆行效应）中减去单眼段内观察到的差异（可能与视网膜膝状体传入的营养支持减少相关）时，MD和MI组的发育曲线相似（图5C）。这种比较被认为隔离了双眼竞争的效果，因此显示MI和MD在这方面相当。另一方面，假设的视网膜膝状体影响的打断明显不同，如单眼段中观察到的效果所证明。正如不活跃的肌纤维在暂时沉默的运动神经元活动恢复时迅速恢复大小一样，我们想知道归因于降低视网膜活动的dLGN细胞大小变化是否同样短暂。在先前的研究中，我们证明在10周龄施加的同伴眼视网膜失活可以促进从先前长期MD效应中恢复，关键是失活对失活眼或连接到它的dLGN层没有持久的损害。因此，我们有兴趣通过为一部分动物在10周龄接受10天视网膜失活后提供双眼视觉来测试视网膜失活效果的持久性。在失活期消退后，连接到先前失活眼的dLGN层具有正常外观，失活眼层内没有染色苍白或神经元萎缩的证据（图6A和D）。这些观察通过高倍图像确认，显示dLGN双眼（图6B）和单眼（图6E）段内眼特异性层之间具有可比的染色特征。胞体大小量化表明，单侧视网膜失活引发的神经元大小变化（图3）通过提供10天双眼视觉而被消除。在双眼段内，神经元大小仅相差5%（失活：平均值=229μm²，SD=10μm²；正常：平均值=250μm²，SD=9；图6C），这不是显著差异（t=0.674，d.f.=6，p>0.05）。类似地，单眼段内神经元胞体大小仅观察到4%差异，也不显著不同（失活：平均值=229μm²，SD=10μm²；正常：平均值=250μm²，SD=9；t=0.068，d.f.=2，p>0.05；图6F）。这些结果表明，MI对dLGN胞体大小的影响是短暂的，至少在关键期峰值之后的年龄施加时如此。
图6. 视网膜失活后双眼视觉恢复的效果。A 10天MI后提供10天双眼视觉的dLGN代表性低倍图像。B 双眼段内先前失活和正常眼层的高倍图像。C 双眼段内先前失活和正常眼神经元的平均横截面积。D 单眼段内先前失活和正常眼层的高倍图像。E 单眼段内先前失活和正常眼层的高倍图像。F 单眼段内先前失活和正常眼神经元的平均横截面积。
从同一组接受视网膜失活后双眼视觉的动物中，我们测量了初级视觉皮层的VEP。与我们的解剖学结果一致，在失活期消退并为动物提供双眼视觉后，视觉反应完全恢复。图7A-C显示来自示例动物左半球的数据，其中在右眼失活10天之前测量了双眼之间的平衡视觉反应（图7A）。在失活第10天，测量显示失活眼中的VEP（蓝色轨迹）被消除，该眼的反应降低到基线（红色轨迹；图7B）。当失活期后提供10天双眼视觉时，通过先前失活眼诱发的VEP恢复到正常，这些反应与从另一只眼诱发的VEP平衡（图7C）。
图7. 视网膜失活后视觉诱发电位的恢复。A 失活前左右眼VEP。B 失活第10天失活眼VEP被消除。C 失活期后10天双眼视觉后VEP恢复。D 左眼VEP功率测量。E 右眼VEP功率测量。
我们接下来为两只动物绘制了右眼失活前、失活期间和失活后左（图7D）和右（图7E）眼的VEP功率测量。在这些图中，左右视觉皮层由符号颜色表示，不同动物由符号形状表示，光栅空间频率由符号组成表示。失活前从正常左眼测量的VEP功率在失活期间或之后没有变化（(F(3,8)=[0.805]，p=0.418)；图7D）。右眼失活显著降低了相对于失活前水平的VEP功率（(F(3,8)=[42.22]，p<0.001；多重比较事后检验：p<0.001）。通过失活眼诱发的VEP功率降低在10天双眼视觉后恢复，与失活前测量的VEP功率没有不同（多重比较事后检验：p=0.639）。值得指出的是，失活后正常dLGN胞体大小的恢复和VEP的恢复发生在这样一个年龄（即10周龄），此时同伴眼失活可以促进从长期MD的解剖学和生理学效应中完全恢复。当前发现表明，失活引发的修改对视觉系统没有持久的负面影响，而是似乎引发了一系列修改，为从弱视饲养引发的神经修改中恢复提供了机会。
四、讨论
在本研究的第一部分，我们比较了单眼眼睑闭合与单眼视网膜失活的效果，作为评估它们各自在发育过程中引发dLGN胞体大小变化能力的手段。10天视网膜失活始终产生比眼睑闭合更大的效果，这在我们检查的所有年龄都观察到。即使在关键期峰值之后的年龄，当MD在dLGN中产生很少或没有效果时，MI修改了沉默视网膜神经节细胞后突触的胞体大小。此外，在所有检查的年龄，失活导致双眼和单眼段内的细胞收缩。这一观察与研究人员（1983）的发现一致，他们在7周龄猫1周失活后获得了类似结果。因此，失活在质上与MD不同，因为后者对单眼段内神经元大小的影响可忽略不计。这是值得注意的，因为它表明这两种剥夺形式之间引发胞体大小变化的机制不相同。而且，尽管MI的急性和广泛效果，我们发现失活的影响可以是暂时的。这是在检查10周龄动物后确定的，这些动物在10天失活后提供了双眼视觉期。在这个年龄，TTX影响消退后不久，dLGN和V1中视网膜失活的效果就被消除了。
单眼视网膜失活TTX已知在成年猫和猴的初级视觉通路内产生多种神经解剖学变化。在猴V1中，与失活眼相关的眼优势柱内微管相关蛋白丢失。GABA及其合成酶谷氨酸脱羧酶（GAD）的丢失在猴V1失活眼眼优势柱中明显，以及在服务于失活眼的dLGN层中。在猫和猴中，细胞色素氧化酶染色揭示的氧化代谢在dLGN失活眼层和服务于失活眼的眼优势柱内降低，反映了在失活眼层内测量的神经活动减少。细胞色素氧化酶染色的丢失可以快速发生，即使在仅1天失活后也明显，并随着失活期延长而更加明显。当前研究的发现，与研究人员（1983）的发现一致，证明MI显著减少了连接到受影响眼的dLGN层内细胞大小。MI的效果在双眼和单眼段都明显，这将其与MD区分开来，因为后者仅在双眼段内产生改变。因此，MI的效果不太可能由眼睛之间的竞争失衡解释，因为它在单眼段内观察到，在那里服务于失活眼的膝状体纹状体轴突不受同伴眼轴突的竞争。这提出了MI对dLGN的影响可能直接由紧张性视网膜神经节细胞活动的先行丧失催化的可能性。
失活诱导的后突触胞体变化的可能贡献者可能是视网膜提供的营养支持的修改。dLGN神经元的营养支持由视网膜神经营养因子的选择性顺向运输以活动依赖性方式贡献。视网膜神经节细胞脑源性神经营养因子（BDNF）的顺向运输和释放可以在dLGN靶神经元内诱发即刻早期基因（c-fos和Zif268）的表达。在猫中，2天MI伴随玻璃体内TTX微量注射显著降低dLGN层内以及V1服务于失活眼的眼优势柱内的BDNF水平。虽然普遍认为剥夺诱导的眼优势可塑性是皮层介导的，但增强视觉剥夺耗尽的视网膜BDNF水平可以减轻MD的典型皮层效应，表明视网膜可能影响整个初级视觉通路神经可塑性的可能作用。因此，MI后dLGN细胞收缩可能涉及来自视网膜的营养支持减少，这可能同等地影响双眼和单眼段。当前研究中观察到的失活效果随年龄明显降低，这意味着dLGN神经元对活动依赖性营养支持的依赖同样受年龄调节。无论涉及何种机制，失活在比MD可能的更老年龄仍保持引发细胞大小变化的效力，表明它遵循更持久的关键期，可以利用来延长初级视觉通路神经功能障碍的可逆性。
在我们检查的最年轻动物中，单眼视网膜失活在dLGN双眼段产生的效果约为单眼段测量效果的两倍（图5）。然而，在较老年龄，双眼段内失活效果的大小与单眼段内测量的约相同。根据研究人员（1982），当神经异常发生在两个dLGN段但在双眼段更严重时，提出双眼竞争和非竞争机制的组合。当两个段内的异常同样严重时，提出非竞争机制。因此，我们在关键期峰值附近的较年轻年龄观察到的dLGN双眼段内较大的失活效果可能源于皮层介导的双眼输入之间双眼竞争的组合影响，以及可能包括视网膜营养影响修改的非竞争机制。在较老年龄发生失活时测量的双眼和单眼段之间相当的效果大小表明，发育后期失活的效果源于非竞争机制，这可能合理地归因于紧张性视网膜活动的丧失。
当MI发生在10周龄时，其对dLGN细胞大小的影响显著，且与在关键期峰值施加的同等持续时间MD引发的效果相当。尽管有这种大效果，但随后提供短时间的双眼视觉足以逆转细胞的萎缩。同样，失活期间降低到基线的失活眼VEP，在最终TTX注射后短时间恢复正常。即使当MI发生在7周龄，可塑性能力相当高的时候，MI对dLGN胞体大小的效果也随随后的双眼视觉恢复。在经受MI的猫和猴的初级视觉通路内，细胞色素氧化酶染色的显著减少以及GAD和GABA免疫标记都恢复，并在失活期后的双眼视觉期与正常无法区分。这表明失活不会启动不可逆的退行性过程，导致永久性改变，这将其与确实引发dLGN退化和神经元丧失的单眼摘除区分开来。虽然我们没有直接检查10周龄MI后测量的自发恢复是否在相同年龄缓解的同等MD期后发生，但我们小组的先前研究提供了一些见解。我们先前记录了当10天双眼视觉跟随6周MD（从4周龄开始）时不完全的dLGN恢复。换句话说，虽然MD的效果在10周龄提供双眼视觉时没有解决，但MI的效果确实解决了。虽然在这个比较中MD的时间与MI不同，但它提出了MI和MD之间的额外区别，即MI的效果是暂时的，可以随双眼视觉的恢复而自发解决。重要的是要指出，虽然失活对dLGN和V1内神经元特征的短暂效果已在7周龄猫中记录，但当应用于更年轻年龄时，可能观察不到这些改变的可逆性。事实上，新生儿期开始5-8周失活后，小猫dLGN神经元的异常感受野特性已有记录，表明在出生时附近发生视网膜输出废除可以促进异常视网膜-膝状体连接的发展。
在长期MD之后，眼优势强烈偏向非剥夺眼，小鼠和猫中较强眼睛的失活可以促进较弱眼诱发的视觉驱动皮层反应的恢复。类似的恢复发生在猫dLGN中，MD缩小的剥夺神经元在同伴眼失活10天后恢复到正常大小。这种恢复没有任何可检测的全身毒性，在猫和猴中施用玻璃体内TTX的几项研究报告称，一旦失活期过去，没有眼组织病理学或眼睛正常功能中断的证据。与当前研究的结果一致，显示MI可以在比MD可能的更老年龄引发细胞大小的显著修改，使用同伴眼失活从长期MD效应中恢复可以发生在相同持续时间的反向遮盖无法产生显著恢复的年龄。鉴于我们当前的发现表明10周龄时MI的效果似乎源于非竞争机制，失活诱导的长期MD恢复可能也是由于非竞争机制，而不是通过遮盖疗法发生的眼睛之间创造竞争失衡。MI的形态学效果是否是MD功能恢复的必需仍有待确定。尽管如此，当前研究的结果已描绘了失活的潜在重要特征，这些特征可能有助于其促进神经可塑性的独特效力。调查失活在比迄今检查的更老年龄促进MD恢复的能力将很重要。
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